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细胞凋亡

简介

细胞凋亡是指为维持内环境稳定,由基因控制的细胞自主的有序的死亡。细胞凋亡与细胞坏死不同,细胞凋亡不是一件被动的过程,而是主动过程,它涉及一系列基因的激活、表达以及调控等的作用,它并不是病理条件下,自体损伤的一种现象,而是为更好地适应生存环境而主动争取的一种死亡过程。

人体内的细胞注定是要死亡的,有些死亡是生理性的,有些死亡则是病理性的,有关细胞死亡过程的研究,近年来已成为生物学、医学研究的一个热点,到目前为此,人们已经知道细胞的死亡起码有两种方式,即细胞坏死与细胞凋亡(apoptosis)。细胞坏死是早已被认识到的一种细胞死亡方式,而细胞凋亡则是近年逐渐被认识的一种细胞死亡方式。

细胞凋亡是细胞的一种基本生物学现象,在多细胞生物去除不需要的或异常的细胞中起着必要的作用。它在生物体的进化、内环境的稳定以及多个系统的发育中起着重要的作用。细胞凋亡不仅是一种特殊的细胞死亡类型,而且具有重要的生物学意义及复杂的分子生物学机制。

凋亡是多基因严格控制的过程。这些基因在种属之间非常保守,如Bcl-2家族、caspase家族、癌基因如C-myc、抑癌基因P53等,随着分子生物学技术的发展对多种细胞凋亡的过程有了相当的认识,但是迄今为止凋亡过程确切机制尚不完全清楚。而凋亡过程的紊乱可能与许多疾病的发生有直接或间接的关系。如肿瘤、自身免疫性疾病等,能够诱发细胞凋亡的因素很多,如射线、药物等。

细胞凋亡的生物学特征

1.形态学变化

形态学观察细胞凋亡的变化是多阶段的,细胞凋亡往往涉及单个细胞,即便是一小部分细胞也是非同步发生的。首先出现的是细胞体积缩小,连接消失,与周围的细胞脱离,然后是细胞质密度增加,线粒体膜电位消失,通透性改变,释放细胞色素C到胞浆,核质浓缩,核膜核仁破碎,DNA降解成为约180bp-200bp片段;胞膜有小泡状形成,膜内侧磷脂酰丝氨酸外翻到膜表面,胞膜结构仍然完整,最终可将凋亡细胞遗骸分割包裹为几个凋亡小体,无内容物外溢,因此不引起周围的炎症反应,凋亡小体可迅速被周围专职或非专职吞噬细胞吞噬。

2.生物化学变化

1)DNA的片段化

细胞凋亡的一个显著特点是细胞染色体的DNA降解,这是一个较普遍的现象。

这种降解非常特异并有规律,所产生的不同长度的DNA片段约为180-200bp的整倍数,而这正好是缠绕组蛋白寡聚体的长度,提示染色体DNA恰好是在核小体与核小体的连接部位被切断,产生不同长度的寡聚核小体片段,实验证明,这种DNA的有控降解是一种内源性核酸内切酶作用的结果,该酶在核小体连接部位切断染色体DNA,这种降解表现在琼脂糖凝胶电泳中就呈现特异的梯状Ladder图谱,而坏死呈弥漫的连续图谱。

2) 大分子合成

细胞凋亡的生化改变不仅仅是DNA的有控降解,在细胞凋亡的过程中往往还有新的基因的表达和某些生物大分子的合成作为调控因子。如我们实验室发现的TFAR-19就是在细胞凋亡时高表达一种分子,再如在糖皮质激素诱导鼠胸腺细胞凋亡过程中,加入RNA合成抑制剂或蛋白质合成抑制剂即能抑制细胞凋亡的发生。

细胞凋亡的过程及机理

细胞凋亡的过程大致可分为以下几个阶段:

接受凋亡信号→凋亡调控分子间的相互作用→蛋白水解酶的活化(Caspase)→进入连续反应过程

1.凋亡的启动阶段

细胞凋亡的启动是细胞在感受到相应的信号刺激后胞内一系列控制开关的开启或关闭,不同的外界因素启动凋亡的方式不同,所引起的信号转导也不相同,客观上说对细胞凋亡过程中信号传递系统的认识还是不全面的,目前比较清楚的通路主要有:

1)细胞凋亡的膜受体通路:各种外界因素是细胞凋亡的启动剂,它们可以通过不同的信号传递系统传递凋亡信号,引起细胞凋亡,我们以Fas -FasL为例:

Fas是一种跨膜蛋白,属于肿瘤坏死因子受体超家族成员,它与FasL结合可以启动凋亡信号的转导引起细胞凋亡。它的活化包括一系列步骤:首先配体诱导受体三聚体化,然后在细胞膜上形成凋亡诱导复合物,这个复合物中包括带有死亡结构域的Fas相关蛋白FADD。 Fas又称CD95,是由325个氨基酸组成的受体分子,Fas一旦和配体FasL结合,可通过Fas分子启动致死性信号转导,最终引起细胞一系列特征性变化,使细胞死亡。Fas作为一种普遍表达的受体分子,可出现于多种细胞表面,但FasL的表达却有其特点,通常只出现于活化的T细胞和NK细胞,因而已被活化的杀伤性免疫细胞,往往能够最有效地以凋亡途径置靶细胞于死地。 Fas分子胞内段带有特殊的死亡结构域(DD, death domain)。三聚化的Fas和FasL结合后,使三个Fas分子的死亡结构域相聚成簇,吸引了胞浆中另一种带有相同死亡结构域的蛋白FADD。FADD是死亡信号转录中的一个连接蛋白,它由两部分组成:C端(DD结构域)和N端(DED)部分。DD结构域负责和Fas分子胞内段上的DD结构域结合,该蛋白再以DED连接另一个带有DED的后续成分,由此引起N段DED随即与无活性的半胱氨酸蛋白酶8(caspase8)酶原发生同嗜性交联,聚合多个caspase8的分子,caspase8分子逐由单链酶原转成有活性的双链蛋白,进而引起随后的级联反应,即Caspases,后者作为酶原而被激活,引起下面的级联反应。细胞发生凋亡。因而TNF诱导的细胞凋亡途径与此类似

2)细胞色素C释放和Caspases激活的生物化学途经

线粒体是细胞生命活动控制中心,它不仅是细胞呼吸链和化磷酸化的中心,而且是细胞凋亡调控中心。实验表明了细胞色素C从线粒体释放是细胞凋亡的关键步骤。释放到细胞浆的细胞色素C在dATP存在的条件下能与凋亡相关因子1(Apaf-1)结合,使其形成多聚体,并促使caspase-9与其结合形成凋亡小体,caspase-9被激活,被激活的caspase-9能激活其它的caspase如caspase-3等,从而诱导细胞凋亡。此外,线粒体还释放凋亡诱导因子,如AIF,参与激活caspase。可见,细胞凋亡小体的相关组份存在于正常细胞的不同部位。促凋亡因子能诱导细胞色素C释放和凋亡小体的形成。很显然,细胞色素C从线粒体释放的调节是细胞凋亡分子机理研究的关键问题。多数凋亡刺激因子通过线粒体激活细胞凋亡途经。有人认为受体介导的凋亡途经也有细胞色素C从线粒体的释放。如对Fas应答的细胞中,一类细胞(type1)中含有足够的胱解酶8 (caspase8)可被死亡受体活化从而导致细胞凋亡。在这类细胞中高表达Bcl-2并不能抑制Fas诱导的细胞凋亡。在另一类细胞(type2)如肝细胞中,Fas受体介导的胱解酶8活化不能达到很高的水平。因此这类细胞中的凋亡信号需要借助凋亡的线粒体途经来放大,而Bid -- 一种仅含有BH3结构域的Bcl-2家族蛋白是将凋亡信号从胱解酶8向线粒体传递的信使。

2.凋亡的执行

尽管凋亡过程的详细机制尚不完全清楚,但是已经确定Caspase即半胱天冬蛋白酶在凋亡过程中是起着必不可少的作用,细胞凋亡的过程实际上是Caspase不可逆有限水解底物的级联放大反应过程,到目前为止,至少已有14种Caspase被发现,Caspase分子间的同源性很高,结构相似,都是半胱氨酸家族蛋白酶,根据功能可把Caspase基本分为二类:一类参与细胞的加工,如Pro-IL-1β和Pro-IL-1δ,形成有活性的IL-1β和IL-1δ;第二类参与细胞凋亡,包括caspase2,3,6,7,8,9.10。Caspase家族一般具有以下特征:

1)C端同源区存在半胱氨酸激活位点,此激活位点结构域为QACR/QG。

2)通常以酶原的形式存在,相对分子质量29000-49000(29-49KD),在受到激活后其内部保守的天冬氨酸残基经水解形成大(P20)小(P10)两个亚单位,并进而形成两两组成的有活性的四聚体,其中,每个P20/P10异二聚体可来源于同一前体分子也可来源于两个不同的前体分子。

3)末端具有一个小的或大的原结构域。

参与诱导凋亡的Caspase分成两大类: 启动酶(inititaor)和效应酶(effector)它们分别在死亡信号转导的上游和下游发挥作用。

细胞凋亡的调节

细胞凋亡受到严格调控,在正常细胞Caspase处于非活化的酶原状态,凋亡程序一旦开始,Caspase被活经随后发生凋亡蛋白酶的层叠级联反应,发生不可逆的凋亡。细胞是如何准确而又精确调节细胞凋亡呢?举例如下:

1.凋亡抑制分子:

迄今为止,已发现多种凋亡抑制分子,包括P35,CrmA,IAPs,FLIPs以及Bcl-2家族的凋亡抑制分子。

1)P35和CrmA是广谱凋亡抑制剂,体外研究结果表明P35以竞争性结合方式与靶分子形成稳定的具有空间位阻效应的复合体并且抑制Caspases活性,同时P35在位点DMQD!G被靶Caspases特异切割,切割后的P35与caspase的结合更强,CrmA(Cytokine response modfer A)是血清蛋白酶抑制剂,能够直接抑制多种蛋白酶的活性,但目前还未发现在哺乳动物中发现P35和CrmA的同源分子。

2)FLIPs(FLICE-imhibirory proterins)能抑制Fas/TNFR1介导的细胞凋亡。它有多种变异体,但其N-端功能前区(Prodomain)完全相同,C端长短不一。FLIPs通过DED功能区,与FADD和Caspase-8,10结合,拮抗它们之间的相互作用,从而抑制Caspase8,10募集到死亡受体复合体和它们的起始化。

3)凋亡抑制蛋白(IAPs,inhibitors of Apoptosis protien)为一组具有抑制凋亡作用的蛋白质,首先是从杆状病毒基因组克隆到,发现能够抑制由病毒感染引起的宿主细胞死亡应答。其特性是有大约20氨基酸组成的功能区,这对IAPs抑制凋亡是必需要的,它们主要抑制Caspase3,-7,而不结合它的酶原,对Caspase则即可以结合活化的,又可结合酶原,进而抑制细胞凋亡。

2.Bcl-2家族:

这一家族有众多成员,如Mcl-1、NR-B、A1 、Bcl-w、Bcl-x、Bax、Bak、Bad、Bim等,它们分别既有抗凋亡作用,也有促凋亡的作用。多数成员间有两个结构同源区域,在介导成员之间的二聚体化过程中起重要作用。Bcl-2成员之间的二聚体化是成员之间功能实现或功能调节的重要形式。Bcl-2生理功能是阻遏细胞凋亡,延长细胞寿命,在一些白血病中Bcl-2呈过度表达。

Bcl-2的亚细胞定位已经明确,它在不同的细胞类型可以定位于线粒体、内质网以及核膜上,并通过阻止线粒体细胞色素C的释放而发挥抗凋亡作用。此外, Bcl-2具有保护细胞的功能, Bcl-2的过度表达可引起细胞核谷胱苷肽(GSH)的积聚,导致核内氧化还原平衡的改变,从而降低了Caspase的活性。Bax是Bcl-2家族中参与细胞凋亡的一个成员,当诱导凋亡时,它从胞液迁移到线粒体和核膜。有人研究发现,细胞毒性药物诱发凋亡时,核膜Bax水平的上升与lamin及PARP两种核蛋白的降解呈正相关。用Bax寡核苷酸处理的细胞,只能特异地阻断Lamin的降解,对PARP的降解不起作用。这种效应的调控机制目前仍然不清楚。

总之,细胞凋亡的调节是非常复杂的,参与的分子也非常多,还有很多不为我们所知的机理需要我们一步的探索。

细胞凋亡与医学

1.免疫学:

1)胸腺细胞成熟过程中的凋亡:胸腺细胞经过一系列的发育过程而成为各种类型的免疫活性细胞。在这一发展过程中,涉及了一系列的阳性细胞选择和阴性细胞选择过程。以形成CD4+的T淋巴细胞亚型及CD8+的T淋巴细胞亚型;同时,对识别自身抗原的T细胞克隆进行选择性地消除,其细胞克隆死亡的机制主要是通过程序性细胞死亡。因此,正常的免疫系统发育的结局,既形成了有免疫活性的淋巴细胞,又产生了对自身抗原的免疫耐受。耐受机制的形成,主要靠识别自身抗原的T淋巴细胞克隆的程序性细胞死亡机制的活化。

2)活化诱导的细胞死亡:(activation-induced cell death,AICD)是T淋巴细胞程序性死亡的又一个主要类型。正常的T淋巴细胞在受到入侵的抗原刺激后,T淋巴细胞被激活,并诱导出一系列的免疫应答反应。机体为了防止过高的免疫应答,或防止这种免疫应答无限制地发展下去,便有AICD来控制激活T细胞的寿命。实际上:T淋巴细胞的增殖与T淋巴细胞AICD具有共同的信号通路。T淋巴细胞受到刺激后就开始活化,活化以后的T淋巴细胞如果有生长因子的存在,即发生生殖反应,如果没有或较少的生长因子的存在,则发生AICD。3)淋巴细胞对靶细胞的攻击:免疫活性细胞,特别是淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK),是过继性免疫治疗的一种重要形式。在抗肿瘤、抗病毒及免疫调节中具有重要作用。这些免疫活性细胞在攻击肿瘤细胞、病毒感染的细胞时,可诱导靶细胞发生程序性死亡。

2.临床医学:

细胞凋亡之所以成为人们研究的一个热点,在很大程度上决定于细胞凋亡与临床病毒的密切关系。这种关系不仅表现在凋亡及其机制的研究,阐明了一大类免疫病的发病机制,而且由此可以导致疾病新疗法的出现,特别是细胞凋亡与肿瘤及爱滋病之间的密切关系倍受人们重视。

1) HIV病毒感染造成CD4+细胞减少是通过细胞凋亡机制

HIV感染引起爱滋病,其主要的发病机制是HIV感染后特异性地破坏CD4+细胞,使CD4+以及与其相关的免疫功能缺陷,易招致机会性感染及肿瘤,但HIV感染后怎样特异性破坏CD4+细胞呢?近年认为,CD4+T淋巴细胞绝对数显著减少的原因,主要是通过细胞凋亡机制造成的。这不仅阐明了AIDS时CD4+T细胞减少的主要原因,同时也为AIDS的治疗研究指明了一个重要的探索方向。

2)从细胞凋亡角度看,肿瘤的发生是由于凋亡受阻所致

一般认为恶性转化的肿瘤细胞是因为失控生长,过度增殖,从细胞凋亡的角度看则认为是肿瘤的凋亡机制受到抑制不能正常进行细胞死亡清除的结果。肿瘤细胞中有一系列的癌基因和原癌基因被激活,并呈过表达状态。这些基因的激活和肿瘤的发生发展之间有着及为密切的关系。癌基因中一大类属于生长因子家族,也有一大类属于生长因子受体家族,这些基因的激活与表达,直接刺激了肿瘤细胞的生长,这些癌基因及其表达产物也是细胞凋亡的重要调节因子许多种类的癌基因表达以后,即阻断了肿瘤细胞的凋亡过程,使肿瘤细胞数目增加,因此,从细胞凋亡角度来理解肿瘤的发生机制,是由于肿瘤细胞的凋亡机制,肿瘤细胞减少受阻所致。因此,通过细胞凋亡角度和机制来设计对肿瘤的治疗方法就是重建肿瘤细胞的凋亡信号转递系统,即抑制肿瘤细胞的生存基因的表达,激活死亡基因的表达。

3)细胞凋亡的研究将给自身免疫病带来真正的突破

自身免疫病包括一大类难治性的免疫紊乱而造成的疾病,自身反应性T淋巴细胞及产生抗体的B淋巴细胞是引起自身免疫病的主要免疫病理机制,正常情况下,免疫细胞的活化是一个极为复杂的过程。在自身抗原的刺激作用下,识别自身抗原的免疫细胞被活化,从而通过细胞凋亡的机制而得到清除。但如这一机制发生障碍,那么识别自身抗原的免疫活性细胞的清除就会产生障碍。有人观察到在淋巴增生突变小鼠中观察到Fas编码的基因异常,不能翻译正常的Fas跨膜蛋白分子,如Fas异常,由其介导的凋亡机制也同时受阻,便造成淋巴细胞增殖性的自身免疫疾患。

4)神经系统的退行性病变:目前知道老年性痴呆是神经细胞凋亡的加速而产生的。阿尔茨海默病(AD)是一种不可逆的退行性神经疾病,淀粉样前体蛋白(APP)早老蛋白-1(PS1)早老蛋白-2(PS2)的突变导致家族性阿尔茨海默病(FAD)。研究证明PS参与了神经细胞凋亡的调控PS1、PS2的过表达能增强细胞对凋亡信号的敏感性。Bcl-2基因家族两个成员Bcl-xl和Bcl-2参与对细胞凋亡的调节。

细胞凋亡的检测

1. 早期检测:

1) PS(磷脂酰丝氨酸)在细胞外膜上的检测:

PS从细胞膜内侧转移到外侧在细胞受到凋亡诱导后不久发生, 可能作为免疫系统的识别标志。AnnexinV,一个钙依赖性的磷脂结合蛋白,能专一性的结合暴露在膜外侧的PS,再通过简单的显色或发光系统进行检测。由于这是一种凋亡早期的活细胞检测(悬浮细胞和贴壁细胞都适用),可与DNA染料或别的晚期检测方法相结合来标记凋亡的发展阶段。

美国著名生物试剂公司CLONTECH和INTERGEN公司分别开发了多种标记的Annexin V产品,简便快速,10分钟就可完成检测。其中带荧光标记的Annexin V-EGFP(Enhanced Green Fluorescent Protein)及Annexin V-FITC,灵敏度高,可作为FACS(流式细胞分选)方法筛选凋亡细胞的基础。由于融合蛋白Annexin V-EGFP,EGFP与PS 的结合比例为1:1,还可进行定量检测。除此之外,还提供生物素偶联的Annexin V,可通过常用的酶联显色反应来检测。另外,MACS公司将磁珠包被Annexin V,可采用磁分选方法筛选凋亡细胞。

2)细胞内氧化还原状态改变的检测:

这反应了细胞凋亡研究中相对较新的趋势,研究什么样的氧化还原环境引起下游事件的发生。CLONTECH公司的ApoAlertTM Glutathione Detection Kit通过荧光染料monochlorobimane(MCB)体外检测凋亡细胞细胞质中谷光苷肽的减少来检测凋亡早期细胞内氧化还原状态的变化。正常状态下,谷光苷肽(glutathione:GSH)作为细胞的一种重要的氧化还原缓冲剂。细胞内有毒的氧化物通过被GSH还原而定期去除,氧化型的GSH又可被GSH还原酶迅速还原。这一反应在线粒体中尤为重要,许多呼吸作用中副产物的氧化损伤将由此被去除。在Jurcat和一些其它类型的细胞中,细胞膜中有可被凋亡信号启动的ATP依赖的GSH转移系统。当细胞内GSH的排除非常活跃时,细胞液就由还原环境转为氧化环境,这可能导致了凋亡早期细胞线粒体膜电位的降低,从而使细胞色素C(三羧酸循环中的重要组分)从线粒体内转移到细胞液中,启动凋亡效应器caspase的级联反应。

由于 GSH与氧化还原作用及线粒体功能密切相关,此项检测除了对研究细胞凋亡的起始非常有用外,还可用于心脏病、中风等疾病治疗的研究。但有些细胞如:HeLa 和3T3细胞凋亡时没有明显的GSH水平的变化,不能用此法检测。

3)细胞色素C的定位检测

细胞色素C作为一种信号物质,在细胞凋亡中发挥着重要的作用。正常情况下,它存在于线粒体内膜和外膜之间的腔中,凋亡信号刺激使其从线粒体释放至细胞液,结合Apaf-1 (apoptotic protease activating factor-1)后启动caspase级联反应:细胞色素C/Apaf-1复合物激活caspase-9,后者再激活caspase-3和其它下游caspase。细胞色素C氧化酶亚单位Ⅳ(cytochrome c oxidase subunit Ⅳ:COX4)是定位在线粒体内膜上的膜蛋白,凋亡发生时,它保留在线粒体内,因而它是线粒体富集部分的一个非常有用的标志。

ApoAlertTMCell Fractionation Kit不用超离心,可从凋亡和非凋亡细胞中快速有效分离出高度富集的线粒体部分,再进一步通过Western杂交用细胞色素C抗体和COX4抗体标示细胞色素C和COX4的存在位置,从而判断凋亡的发生。

4) 线粒体膜电位变化的检测:

在凋亡研究的早期,从形态学观测上线粒体没有明显的变化。随着凋亡机制研究的深入,发现线粒体凋亡也是细胞凋亡的重要组成部分,发生很多生理生化变化。例如,在受到凋亡诱导后线粒体转膜电位会发生变化,导致膜穿透性的改变。MitoSensorTM,一个阳离子性的染色剂,对此改变非常敏感,呈现出不同的荧光染色。正常细胞中,它在线粒体中形成聚集体,发出强烈的红色荧光。凋亡细胞中,因线粒体穿膜电位的改变,它以单体形式存在于细胞液中,发出绿色荧光。用荧光显微镜或流式细胞仪可清楚地分辨这两种不同的荧光信号。CLONTECH公司的ApoAlert Mitochondrial Membrane Sensor Kit就采用这种原理来检测线粒体膜电位的变化。但是,这种方法不能区分细胞凋亡或其他原因导致的线粒体膜电位的变化。

2. 晚期检测:

细胞凋亡晚期中,核酸内切酶(某些Caspase的底物)在核小体之间剪切核DNA,产生大量长度在180-200 bp 的DNA片段。对于这一现象的检测通常有以下两种方法:

1) TUNEL(Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end-labeling)

通过DNA末端转移酶将带标记的 dNTP (多为dUTP)间接(通过地高辛)或直接接到DNA片段的3’-OH端,再通过酶联显色或荧光检测定量分析结果。美国Intergen公司提供多种标记方法,直接荧光标记,地高辛介导荧光标记或过氧化物酶联显色,可做细胞悬液、福尔马林固定或石蜡处理的组织、细胞培养物等多种样本的检测。其中,直接标记步骤少,操作简便。而间接标记有信号放大的作用,检测灵敏度高。

2) LM-PCR Ladder (连接介导的PCR检测)

当凋亡细胞比例较小以及检测样品量很少(如活体组织切片)时,直接琼脂糖电泳可能观察不到核DNA的变化。CLONTECH公司的ApoAlert?LM-PCR Ladder Assay Kit通过LM-PCR(ligation-mediated PCR),连上特异性接头,专一性地扩增核小体的梯度片段,从而灵敏地检测凋亡时产生的核小体的梯度片段。此外,LM-PCR 检测是半定量的,因此相同凋亡程度的不同样品可进行比较。

上述两种方法都针对细胞凋亡晚期核DNA断裂这一特征,但细胞受到其它损伤(如机械损伤,紫外线等)也会产生这一现象,因此它对细胞凋亡的检测会受到其它原因的干扰。

3) Telemerase Detection (端粒酶检测)

这是相对来说推出较早,用得较多的一种方法。端粒酶是由RNA和蛋白组成的核蛋白,它可以自身RNA为模板逆转录合成端粒区重复序列,使细胞获得“永生化”。正常体细胞是没有端粒酶活性的,每分裂一次,染色体的端粒会缩短,这可能作为有丝分裂的一种时钟,表明细胞年龄、复制衰老或细胞凋亡的信号。研究发现,90%以上的癌细胞或凋亡细胞都具有端粒酶的活性。Intergen公司的TRAP-eze Telemerase Detection Kit在1996年率先推出。它提供特定的寡核苷酸底物,分别与底物及端粒重复序列配对的引物。如果待测样本中含有端粒酶活性,就能在底物上接上不同个数的6碱基(GGTTAG)端粒重复序列,通过PCR反应,产物电泳检测就可观察到相差六个碱基的DNA Ladder现象(参见图4)。此外,Intergen公司还提供用酶联免疫法(ELISA)检测的试剂盒.

同样,这种检测方法也不专对细胞凋亡,检测结果也不纯反应细胞凋亡的发生。

3.mRNA水平的检测

研究者们发现了很多在细胞凋亡时表达异常的基因,检测这些特异基因的表达水平也成为检测细胞凋亡的一种常用方法。据报道,Fas 蛋白结合受体后能诱导癌细胞中的细胞毒性T细胞(cytotoxic T cells)等靶细胞。Bcl-2 和bcl-X (长的) 作为抗凋亡(bcl-2 和bcl-X)的调节物,它们的表达水平比例决定了细胞是凋亡还是存活。一般多采用Northern杂交和RT-PCR走胶对它们进行检测。随着近年来荧光定量PCR技术的发展,用定量PCR技术来检测基因表达水平无疑比之前者更快更准确。Intergen公司的Amplifluor? Apoptosis Gene Systems就根据这一新技术原理,通过检测fas, bax-alpha 和 bcl-X (长的) 基因的 mRNA表达水平来进行细胞凋亡的检测。

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